10x Genomics单细胞转录组测序-基迪奥生物

10x Genomics单细胞转录组测序（single cell RNA-seq, scRNA-seq），是在单个细胞水平对 mRNA 进行高通量测序的一项新技术，其能够以高通量和单分子分辨率研究单个细胞表达谱，揭示复杂细胞群体的异质性，避免单个细胞的基因表达信号被群体的平均化所掩盖。

10x Genomics系统具有高通量、周期短、适用范围广等优势，一个样品可进行1000-10000个细胞转录组分析；6.5min可完成上万细胞的封装，一天内完成单细胞捕获、反转录扩增与建库；相较其他平台，单个细胞的测序成本低；适用于绝大部分的细胞类型，包括生殖细胞、胚胎细胞、血细胞、神经细胞、肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞等。

应用领域

1. 发育生物学：胚胎、神经、脑等各种组织；

2. 肿瘤异质性与耐药性研究；

3. 干细胞分化潜能研究；

4. 免疫方向；

5. 细胞图谱绘制。

技术路线

分析内容

标准信息分析

1.测序数据统计与评估：各个样本测序数据基本质控（reads数、测序饱和度等）、各个样本数据比对（细胞数目统计、reads基因组比对率等）、基因表达定量

2.单细胞亚群分类与分类结果可视化：细胞过滤、细胞亚群分类、分类结果可视化（TSNE图）

3.亚群上调表达基因分析：上调表达基因筛选、上调表达基因基因GO/KEGG功能富集分析

4.标记基因筛选以及调控网络分析：标记基因筛选、各标记基因在群体中的表达分布、标记基因蛋白质互作网络分析

高级信息分析

拟时分析

个性化分析

已知标记基因表达分布、多样本亚群间比较、Reactome和DO功能富集分析

样品要求

样本类型：制备好的细胞悬液；

细胞活性：活细胞数在90% 以上；

细胞大小：小于40μm；

细胞培养基及缓冲液不能含有Ca²⁺和Mg²⁺等影响酶活性的物质。

项目周期

标准流程完成时间为50个工作日。

参考文献

1.Maaten L V D, Hinton G. Visualizing Data using t-SNE[J]. Journal of Machine Learning Research, 2008, 9(2605):2579-2605.

2. Adamson B, Norman T M, Jost M, et al. A Multiplexed Single-Cell CRISPR Screening Platform Enables Systematic Dissection of the Unfolded Protein Response[J]. Cell, 2016, 167(7):1867.

3.Zheng G X, Terry J M, Belgrader P, et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells[J]. Nature Communications, 2017, 8:14049.

4.Mcdavid A, Finak G, Chattopadyay P K, et al. Data exploration, quality control and testing in single-cell qPCR-based gene expression experiments[J]. Bioinformatics, 2013, 29(4):461-467.

5.Cell ranger ：http://support.10xgenomics.com/single-cell/software/overview/welcome.

Q1：10X单细胞标记的细胞数目范围一般是多少？细胞标记上的数目是越多越好吗？

A：标记效率官方是65%。实际项目中，如果悬液质量比较好、活性高、杂质少，标记效率甚至高于65%。标记上的细胞多，那么拿到的细胞肯定也多，但是也会有另一个问题，就是单个细胞的数据量少了，所以在实际项目中需要平衡。

Q2：10X单细胞测序5’试剂和3’试剂有什么区别？

A：两种试剂的区别：主要是磁珠breads的序列不同，5’试剂磁珠序列是Switch Oligo(作用主要是把测序接头、barcode、UMI等序列连接再mRNA的5’端)、3’试剂主要是polyT（作用：反转的时候与mRNA的polyA互补结合，实现mRNA的反转）

Q3: 单细胞建库方法5’端和3’端捕获有什么区别？为什么VDJ通常用5‘捕获？

A： 10x单细胞转录组建库有5‘端和3’端建库两种方式。在3’端的建库中，Gel beads的末端序列是poly（dT），用于和转录组3’端的polyA结构互补配对。而在5’端的建库中，Gel beads的末端序列是switch oligo序列，其末端有polyG的结构。转录本会在酶的作用下在其5‘端加上polyC的结构，由此完成配对。

3’:

5’:

VdJ：

VDJ建库的捕获固定采用5’端捕获方法，目的是为了在保证序列长度较短的情况之下富集到位于5’端的多变VDJ区域，而不是位于3’端的较为保守的C区域，这段区域通常不是重点的研究方向。

10X单细胞测序研究儿童结肠炎及炎症性肠病发病机制及治疗方法

合作单位：广州市妇女儿童医疗中心

发表期刊：《cell》

影响因子：36.216

背景

儿童期发病的结肠炎和炎症性结肠炎（PIBD）的发病率逐年增加，该类疾病反复发作、治疗无效率高且费用昂贵。而且PIBD临床表现复杂及致病机制不清严重限制了治疗方法的选择和个性化诊疗的开展。为此，研究团队利用单细胞转录组、单细胞免疫组库和全基因组关联分析（GWAS）探究PIBD的发病机制及可用药物。

研究思路

文章研究思路

研究结果

1. 队列特征与单细胞转录组图谱（分群）

（1）样本选择和队列分析

为了阐述不同亚型病例的致病机制并寻找治疗靶点，研究团队对17名患儿（对包括对照组在内的四组取样，如下图A）的结肠黏膜进行取样测序。研究采用FACS方法分离免疫细胞和非免疫细胞，然后进行单细胞转录组及TCR+BCR测序（针对CD45+免疫细胞同时开展转录组和免疫组库测序）。

单细胞测序结果将免疫细胞和非免疫细胞的数据合并分群，分群如下图（B）。从图中我们可以看出即包含了常见免疫细胞（包括：B细胞、T细胞、NK细胞、髓系细胞等），又包含了非免疫细胞（包括成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞）。

在文章的后续部分，作者将对这些亚群中的上皮细胞、成纤维细胞、髓系细胞以及T/B细胞子亚群进一步进行分析讨论。

图1 队列特征与结肠黏膜单细胞图谱

（2）全基因组关联分析（GWAS）

为了寻找PIBD的风险基因，作者基于210个病例和614个对照进行了全基因组关联分析，定位了244个与PIBD风险基因。这部分风险基因将与后续单细胞亚群特异表达基因进行比较，分析风险基因主要在哪类细胞中起作用。

2. 上皮细胞子亚群分析：PIBD风险基因在哪些子亚群特异表达

将上皮细胞分为了10个子亚群（图2A），值得关注的是其中有两个子亚群没有被鉴定。结合单细胞子亚群分析结果，作者还讨论了PIBD风险基因（来源GWAS结果）在各个子亚群细胞以及分化轨迹中的表达情况（图2D、F）。比如CASP7特异表达与结肠上皮细胞（colonocytes），已报道可能引起肠上皮（coloncytes）凋亡；PIEZO1特异表达在Goblet细胞上，与激活的离子通道相关。

通过这一步简单的分析，就实现了传统GWAS分析与单细胞转录组数据的关联。

图2上皮细胞子亚群分析以及GWAS分析结果的关联

3. 成纤维细胞以及皮细胞子亚群分析——儿童结肠炎及炎症性肠病结肠黏膜富集炎性成纤维细胞且血管生成增加

分析得到结肠黏膜成纤维细胞共7个亚群以及和血管内皮细胞1个子亚群（图3A），分析得到8个子亚群特异表达的基因（图3B）。这些子亚群在4组样本里明显比例不同 (图3C)。值得注意的，作者不仅仅是根据前人报道的marker，也会根据子亚群特异表达的转录因子，潜在功能等信息来定义子亚群。

图3 PIBD与对照组的成纤维与内皮细胞组成与功能差异

4. 髓系细胞子亚群分析——儿童结肠炎及炎症性肠病结肠黏膜富集高炎性髓系细胞

髓系细胞在患者组中的比例显著要高于对照组（图4A）。髓系细胞全部可表达CD68，可以分为10个子亚群。通过亚群特异表达基因的pathway富集分析，作者定位了几个值得关注的核心通路（图4E），例如NF-kappa B signaling pathway, TNF signaling pathway等。

图4 PIBD结肠黏膜富集炎性髓系细胞

5. B细胞的子亚群分析——单细胞转录组以及BCR免疫组库分析

作者对两类B细胞分别开展讨论和分析：组织驻留的记忆B细胞（可以转化为浆细胞）以及浆细胞（即效应B细胞）。相对对照组，作者发现CD19+ 记忆B细胞在结肠炎组比例显著上升，分化后的B细胞——CD138+浆细胞则在IBD组显著上升（图5A）。通过子亚群分类，CD19+ B细胞分为了7个子亚群，CD138+浆细胞分为了2个子亚群（图5B）,同样也分析讨论了这些子亚群的关键标记基因（图5C）。对于B细胞，该研究同时进行了单细胞BCR免疫组测序。

分析发现，在Brm-CD27lo, plasmablast(浆母细胞)和plasma cells（浆细胞）中BCR的克隆显著扩增（具有更多的BCR种类）。通过分析记忆B细胞和浆细胞共有的BCR种类所占比例，推测浆细胞的转化来源。分析发现大部分浆细胞是由Brm-CD27lo类型的记忆B细胞转化而来的（图5E）。在PIBD患者（UC和CD）组，lgG+ 浆细胞比例显著上升，这与之前报道lgG+ 浆细胞会促进PIBD病程发展一致（图5F）。最后，作者重点关注了浆细胞中在病例组高表达的与NF-kB激活相关的基因（图5G-H）。

图5 B细胞子亚群转录组以及BCR分析

6.T细胞、NK细胞的子亚群分析——单细胞转录组以及TCR免疫组库分析

对于T细胞和NK细胞，一共又可以分为16个子亚群（图6A），作者同样整理了子亚群特异表达的基因（图6B），尤其是子亚群特异表达的转录因子（图6C-D）。类似B细胞分析，作者也分析了两大类T细胞（CD4+和CD8+）中TCR的多样性（图6E），以及通过分析不同类型T细胞共有的TCR，推测它们的转化关系（图6F）。

值得关注的是，细胞表面表达的核酸水解酶CD39 (由ENTPD1编码) 在CD8+和Vδ1+T细胞的表达在PIBD各亚型中显著降低（图6G）。为了寻找与ENTPD1相关的基因，作者采用共表达分析的方法，发现GPR65, CD247 (编码TCR zeta 链),和MAP3K8 三个关键基因与ENTPD1表达正相关。

图6 T细胞/NK细胞转录组以及TCR分析

7. 双嘧达莫在防治儿童结肠炎及炎症性肠病方面的应用前景

研究团队利用腹腔注射双嘧达莫的方式对硫酸葡聚糖（DSS）诱导的急性肠炎小鼠进行了治疗，发现双嘧达莫可以显著改善小鼠的体重、结肠长度和结肠的组织病理结构，抑制小鼠结肠黏膜的血小板聚集和TNFα的释放（图7A-D）。

对9例患儿（8例结肠炎和1例未定型PIBD）开展了双嘧达莫的小样本临床试验，发现患者的血小板计数，结肠镜评分和临床综合评分均有明显改善（图7E）。其可能的机制是双嘧达莫通过cAMP-PKA-ERK-ATF2/CREB途径提高CD39的表达，从而抑制血小板的聚集和活化（图7F-G）；同时，该药可以抑制CD68+髓系细胞及TNFα的释放（图7H），最终缓解临床症状。