蛋白非标记定量分析是指不需要稳定同位素标记样本,每个样本分别上机检测。由于不需要对样本进行标记,蛋白非标记定量分析技术成本较低,并且对一次检测的样本量无限制,可同时比较多个样本的蛋白质表达差异。
 
 
根据质谱数据采集模式的不同,蛋白非标记定量又分为利用数据依赖采集模式(DDA)的label free方法(LFQ),和利用数据非依赖采集模式(DIA)的DIA方法。蛋白定量DIA技术将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口,高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测,因此可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息,数据利用度大大提高,缺失值更少。因此重复性大幅提升,定量准确性更高。蛋白定量DIA技术被Nature Methods杂志评为2015年最值得关注的技术,近年来受到了越来越多的关注。
 
 

 

应用领域

  1. 不同处理、不同生理/病理状态下样本中的蛋白质表达变化
  2. 蛋白DIA定量技术特别适合大样本量的蛋白质研究

 

 

技术路线
             

 

分析内容

 
1. 标准信息分析 2. 定制化信息分析
a) 质谱准确度评估
b) 参考蛋白数据库建立(DIA)
c) 蛋白数据库建立与Mascot软件搜索(LFQ)
d) 蛋白质鉴定与定量
e) 蛋白质功能注释(GO功能、KEGG代谢通路、COG/KOG)
f) 蛋白高级注释(蛋白结构域分析、转录因子分析、亚细胞定位分析)
g) 差异蛋白分析(差异基因筛选、差异比较火山图、差异比较热图)
h) 差异蛋白GO/KEGG/DO/Reactome功能富集分析(DO仅限人、Reactome仅限部分物种)
i) GSEA(GO/KEGG/DO/Reactome,DO仅限人、Reactome仅限部分物种)
a) 蛋白质组与转录组关联分析
b) 蛋白互作网络分析
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

样本要求

1. 新鲜动物组织:≥200mg
2. 新鲜植物组织:≥2g
3. 新鲜培养细胞:≥5*106个细胞每管,3管
4. 真菌、细菌:≥200mg
5. 血清、血浆:150μl * 4管
6. 体液样本:尿液:5ml *4管(送样前需1000g离心5min,弃去沉淀),其他体液(唾液、羊水、细胞培养上清液等)要求5ml以上。
7. 蛋白溶液:蛋白总量500μg以上

 

 

项目周期

标准流程的运转周期约为55个工作日

 

 

参考文献

[1] Hu A, Noble W S, Wolfyadlin A, et al. Technical advances in proteomics: new developments in data-independent acquisition.[J]. F1000Research, 2016.
[2] Sajic T, Liu Y, Aebersold R, et al. Using data-independent, high-resolution mass spectrometry in protein biomarker research: Perspectives and clinical applications[J]. Proteomics Clinical Applications, 2015: 307-321.[3] Musa Y R, Boller S, Puchalska M, et al. Comprehensive Proteomic Investigation of Ebf1 Heterozygosity in Pro-B Lymphocytes Utilizing Data Independent Acquisition.[J]. Journal of Proteome Research, 2018, 17(1):76

 

 

 

Q1: 如何评判样本能否做代谢组或蛋白组(比如-80℃保存了两年、或者用麻醉剂进行处理)?

A: 针对这种情况要咨询公司销售,评估样本的可检测性。一般情况下,样本-80℃保存半年对蛋白、代谢检测影响不大,可正常使用。如果保存时间更久,可与销售咨询,进行预实验,通过预实验的检测结果判断样本情况。

 

 如果使用麻醉剂等试剂对样本进行预处理,对物质检测结果一定会有影响的。

 

 

Q2蛋白、代谢检测可否分批送样?

A: 不建议分批送样,因为仪器稳定性、实验操作人员不同、质谱仪保养清洁等原因会导致不同批次检测结果出现明显的批次效应,且批次效应很难消除,有时批次间的差异会大于样本间的差异。如果真的由于试验需要时间梯度或者样本自身原因,建议先取样,用液氮猝灭后至于-80℃保存,等到所有样本收集完再统一检测。

 

Q3如何选择蛋白质组检测方法?

A: 如果研究常规蛋白质组,在样本数少于32个时,建议使用TMT,大于32个时可使用DIA或者direct DIADIAdirect DIA的区分主要在于,direct DIA不需要建库,可直接使用DIA结果进行定性定量,整个项目周短,成本低。

 

 Q4: DIA技术优势这么明显,现在很受欢迎,那蛋白质检测是不是只用DIA就可以?

A: 并不是,研究人员需要根据研究目的选择更合适的技术。

如,做常规蛋白质组实验,样本数是16个,我们更建议大家使用TMT

原因有:1)定量结果更多。对于常规动植物组织,TMT可通过大量的分级(fractionation),提升定量蛋白的数量,而DIA不做分级,定量的结果要低于TMT;

2)无法发挥DIA稳定性。TMTpro可对16个样本同时标记,混合上机检测,没有平行性的问题。而DIA则是16个样本单独上机检测,DIA的稳定性没有发挥空间。

3)性价比不高。 DIA的实验流程比较复杂,需先建一个图谱library。在样本数量少的情况下,先花机时完成libirary构建,再花机时进行样本的DIA检测。反而不如一次性做TMT来得经济、快捷。

 

如果是样本数较多(大于32个)或者检测血液样本时可优先选择DIA

 

 

 

 

 

Ebf1杂合型祖B淋巴细胞的蛋白质组研究

发表期刊:Journal of Proteome Research

影响因子:4.268

 

早期B细胞因子1(EBF1)是B细胞分化发育的关键转录因子。有报道称Ebf1单倍剂量不足可诱发白血病。本文利用DIA和shutgun DDA技术对Ebf1+/+细胞和Ebf1+/-细胞的蛋白质组进行检测和比较,研究Ebf1杂合性和剂量对祖B淋巴细胞蛋白质组的影响。

 DDA和DIA的结果比较发现,DIA比DDA鉴定出更多的肽段和蛋白,并且生物学重复样本间的重现性更高(图1 A,B);DIA比DDA得到更多的差异蛋白(图1 C),两者共有的差异蛋白的变化趋势都高度一致(图1 D),说明了DIA与DDA方法的一致性。关键转录因子如EBF1, Pax5, TCF3等的表达量,无论是在DDA还是DIA的结果中都是在Ebf1+/-细胞中表达下调。

图1 DDA DIA结果的比较

 

 

 

 

 

 

图2 目标蛋白验证

图3 祖B淋巴细胞的功能调控网络

利用PRM,western blot和qPCR方法验证EBF1以及其他关键转录因子蛋白的表达量,结果都表明了Ebf1+/-祖B细胞中EBF1, Pax5, TCF3等蛋白表达量下调,与DIA结果一致(图2)。

对差异表达蛋白进行功能分析,发现EBF1杂合性导致至少8个参与淋巴细胞增殖的转录因子表达异常,从而影响了祖B淋巴细胞的存活、发育和分化(图3)。这些结果表明祖B淋巴细胞生成受到复杂的基因网络调控,不同转录因子之间相互作用,共同调控祖B淋巴细胞的生成。

 

 

 

 

 

 

参考文献

Musa Y R, Boller S, Puchalska M, et al. Comprehensive Proteomic Investigation of Ebf1 Heterozygosity in Pro-B Lym-phocytes Utilizing Data Independent Acquisition.[J]. Journal of Proteome Research, 2018, 17(1):76.