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完整的转录本包括了从5’端到3’端polyA尾的序列，长度集中分布在1-6kb。二代测序技术由于读长较短，得到的测序片段需要拼接，得到的转录本可能会产生拼接错误和较多的嵌合体，从而不能得到完整的转录本。第三代测序技术Pacbio利用单分子实时测序技术（SMRT），由于其超长的读长（平均15kb），无需拼接即可直接获取完整的全长转录本，因此可得到更高质量的转录本，有利于mRNA结构的研究，如可变剪切、融合基因、等位基因表达等。因此，全长转录本的研究越来越热门，发表的文章影响因子也比简单用二代测序RNA-seq要高。
目前第三代测序仪器最主要是美国太平洋生物技术公司（ Pacific Biosciences）的RS II和Sequel。Sequel也是基于单分子实时测序技术的最新测序平台，其数据产出比RS II提高了约7倍，测序成本更低、项目周期更短。 |
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利用Pacbio三代测序仪进行全长转录组的测序有以下优势：
1. 超长读长：读长最长可达到约80kb，平均8~15kb，轻松解决二代测序所不能解决的重复序列问题；
2. 通量高：RS II平台一个SMRT cell可产生约0.5~1Gb数据，而Sequel平台一个SMRT cell可产生5~10Gb数据；
3. 无GC偏好性：
4. 直接检测碱基修饰：可直接检测各种类型的DNA甲基化。
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应用领域
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1. 完善物种基因组注释
2. 不同实验处理后引起的可变剪切事件变化
3. 转录后调控机制研究，如可变多聚腺苷酸化
4. 癌症发生中的融合基因研究
6. 更准确的定量分析
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分析内容
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1. 标准信息分析
a) 原始测序数据统计及质控
b) Reads分类
c) Reads聚类和校正
d) 全长isoform数据统计
e) 比对参考基因组
f) 新转录本预测
g) 新转录本功能注释
1) Nr注释
2) GO功能注释
3) KEGG代谢通路注释
4) SwissProt蛋白注释
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h) 基因结构分析
1) lncRNA分析
2) 可变剪切分析
3) 可变多聚腺苷酸化分析
4) 融合基因分析
5) SNP/InDel分析
6) 开放阅读框分析
7) 转录因子分析
8) 基因结构优化
2. 定制化信息分析
a) 二代数据校正三代数据（需有Illumina数据）
b) 基因定量及差异表达分析（需有Illumina数据）
c) 多组学关联分析（如甲基化、蛋白组、miRNA）
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胶图检测：条带清晰，无明显降解，无DNA污染
2100检测：RIN值≥7.5，基线平整，200-1200bp 无峰带；
总量≥10ug（两次建库）；浓度≥300ng/ul
OD260/280：1.6~2.2，OD260/230：1.4~2.5
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| 标准流程的运转周期约为55个工作日 |
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参考文献
[1] Wang B , Tseng E , Regulski M , et al. Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing[J]. Nature Communications, 2016, 7:11708.
[2] Li Y , Dai C , Hu C , et al. Global identification of alternative splicing via comparative analysis of SMRT- and Illumina-based RNA-seq in strawberry[J]. The Plant Journal, 2017, 90(1):164-176.
[3] Identification of a novel fusion transcript between human relaxin-1 (RLN1) and human relaxin-2 (RLN2) in prostate cancer[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2016, 420:159-168.
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Q1：相比于二代转录组，三代转录组有哪些优势？ A：（1）超长读长，可一次将真核生物的全长转录本信息读取完整； （2）无需进行片段打断和拼接，避免出现组装错误； （3）基于全长转录组测序得到的完整准确的转录本信息，结合二代数据，方便识别特异性表达且做更加精确的基因和转录本表达定量； （4）针对有参考基因组的物种，全长转录组信息可以纠正基因组的错误组装、更准确地发现新的转录本和基因、分析基因融合事件等； （5）无需链特异性建库，全长转录组测序可直接获取正义链、反义链及部分LncRNA信息。
Q2：三代全长转录组RNA样本要求？ A：三代全长转录组不同于二代转录组，转录本没有打断的过程，对于转录本的完整性要求更高（全长），目前三代全长转录组（真核生物），对RNA样本的要求：浓度≥300ng/μl，总量≥5μg，RIN值≥7.5。
Q3：全长转录本的应用方向？ A：（1）基因结构的研究：可变剪接、APA、融合基因、基因家族、lncRNA及其靶基因预测； （2）完善基因组注释:对于做基因组组装研究的，可以做三代转录组测序辅助基因组注释，对于基因组注释结果不好的，同样也可以利用三代结果来完善注释； （3）基因功能研究:要获得整个转录本全长，获得CDS区域以及这个转录本所能够编码的蛋白，则需要做RACE实验的，而RACE成功率低且价格贵，这时候可以通过三代测序获得全长，无需RACE实验； （4）与蛋白组联合分析:构建完善的蛋白搜索库;可变剪接事件的相互验证。
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| 可变剪切（alternative splicing，AS）是指mRNA前体通过不同的剪接方式产生不同的mRNA剪接异构体，从而使一个基因产生多个不同的mRNA转录本，进而能够翻译成多种不同的蛋白。AS是调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要原因，在人和动植物中都起着重要的转录调控作用，与生长发育、细胞分化、细胞功能等方面密切相关。 |
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通过对野生草莓（F. vescaYW5AF7）5个发育阶段（small green, big green, turning, pink, red）的花托进行混样，分别进行SMRT测序和Illumina测序。SMRT测序结果显示，89.2%的ROI比对到了草莓基因组的13284个注释基因上（基因组共有33673个基因），校正后96.4%的一致性序列比对到参考基因组上，然后去冗余后最后得到33236条转录本。其中5501条为新转录本（novel），26737条为已知转录本（known）。比较两个平台鉴定到的AS事件发现，两者剪接位点的分布（图1b）和类型相似（图1c），SMRT鉴定到 57.67%的多外显子基因发生了可变剪切，拥有多条可变剪切异构体（spliced isoforms），其中10%的基因拥有多于5条的spliced isoforms。二代测序数据中，只有33.48%的多外显子基因发生了可变剪切（图1d）。 |
图1 SMRT和Illumina测序结果比较
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图2 生长素和脱落酸信号通路相关基因AS事件鉴定 |
AS导致了基因功能结构域的丢失或获得，或者导致转录本的提前终止，从而影响了基因编码蛋白的功能。进一步分析可变剪切功能发现，在草莓的发育过程中，AS影响了与草莓发育过程相关的基因与转录因子的功能，如果实变软基因FaExp1、β半乳糖苷酶基因FaβGal1、生长素信号通路转录因子FvARF17等。 |
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参考文献 Li Y, Dai C, Hu C, et al. Global identification of alternative splicing via comparative analysis of SMRT-and Illumina-based RNA-seq instrawberry[J]. The Plant Journal, 2017, 90(1): 164-176. |
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