混合分组分析(Bulked-Segregant Analysis, BSA),又叫QTL-seq,用于质量性状或有主效基因的数量性状的基因定位,在遗传育种方面具有广泛的应用。选择两个性状差异较大的亲本进行杂交,对性状表型极端的子代进行DNA混池测序。通过计算两个混池基因型频率的差值,确定与性状相关的QTL所在的区域。进一步结合该区间的编码基因的突变信息,可以确定控制性状的候选基因以及候选功能突变。
 
 
 
 
应用领域
1. 质量性状或有主效基因的数量性状(例如,植物抗病性)的基因初定位
2. 单一性状的研究
 
 
 
技术路线

 

 

分析内容

 

1.测序数据质量评估 (碱基组成分布等)
2.原始数据过滤,去除含接头reads、低质量reads
3.与参考基因组比对
3.1 比对基因组统计
3.2 插入片段统计
3.3 基因覆盖度分析
3.4 测序深度分析
4.SNP分析统计
4.1 SNP 检测
4.2 SNP位置和功能注释
4.3 SNP转换和颠换信息统计
4.4 SNP杂合信息统计
 
5.InDel 分析统计
5.1 InDel 检测
5.2 InDel 位置和功能注释
5.3 InDel杂合信息统计
6. BSA分析
6.1 亲本间多态性比较
6.2子代SNP频数分析(SNP index和 ΔSNP index计算)
6.3 目标性状相关区域定位
6.4 目标区域候选基因分析
 
 
 
 
 
 
 
 
样品要求

样品浓度≥30ng/uL;总量≥6 μg ;OD260/280 = 1.8~2.0

 
 
 
项目周期
标准流程完成时间为50个工作日(视具体样本数决定)

 

 

参考文献

[1] Xue H, Shi T, Wang F, et al. Interval mapping for red/green skin color in Asian pears using a modified QTL-seq method[J]. Horticulture research, 2017, 4: 17053.

[2] Chen Q, Song J, Du W P, et al. Identification, Mapping, and Molecular Marker Development for Rgsr8. 1: A New Quantitative Trait Locus Conferring Resistance to Gibberella Stalk Rot in Maize (Zea mays L.)[J]. Frontiers in plant science, 2017, 8: 1355.

[3] Watanabe S, Tsukamoto C, Oshita T, et al. Identification of quantitative trait loci for flowering time by a combination of restriction site–associated DNA sequencing and bulked segregant analysis in soybean[J]. Breeding science, 2017, 67(3): 277-285.

 

 

 

 

Q1怎么确定性状是质量性状还是数量性状?

A:根据统计子代个体的性状分离比进行判断。质量性状子代分离比例为3:1,主效基因控制的数量性状子代分离比例接近3:1。

 

Q2BSA、MutMap、MutMap+、MutMap-Gap四种方法适用的材料及分析方法上有和差异?

A:四种方法都是基于纯合基因型亲本的,都是通过杂交家系中具有极端性状个体混合测序,计算SNP-index来实现基因定位。所适用的材料和测序样本如下:

 

 

 

 

 

BSA + RNA-seq:高效筛选目标基因

发表期刊《Frontiers in Plant Science》

合作单位:青海大学

影响因子:4.402

研究样本

通过油菜种间杂交获得突变体F1(正常可育),F2表现出性状分离。再不断自交培育,获得近等基因系(near isogenic lines, NILs),包括不育和可育两种表型,作为研究材料(图1)。

研究思路

 

研究结果

1.不育和可育表型的遗传分析

在早期开花时,分析F7F9代花蕾的可育性,结果显示可育:不育呈现3:1性状分离规律,说明不育的性状主要由一个隐性基因控制。

 

表1. 表型的遗传分析

图2. SNP index和ΔSNP index曼哈顿图

2.全基因组重测序(BSA分析)

总共得到47.25G的raw data和46.80 G的clean data,两个样本的平均reads覆盖深度24.99× 至26.20×。clean data比对基因组后,可育和不育pool大约鉴定到2,813,972个SNPs。通过计算SNP index和ΔSNP index发现候选基因可能位于3号染色体(C3)上的3个不同基因组区间 (35.4035.68,35.7435.75和45.3446.45Mb)(图2)。

 

3.遗传标记和连锁分析

基于BSA测序结果,针对C3区域设计(图3A)64个InDel markers,结果显示6个marker在514个不育样本(F7和F8)中有多肽性。连锁分析显示这些makers有一定重组并且位于C3的45.3446.45 Mb区域,排除了另外两个区域,缩小了候选基因的区域范围(图3b)。

图3. 鉴定油菜育种相关基因。(A)ΔSNP index显示C3候选区域;(B)基于分子标记的连锁分析验证候选基因基因组位置;(C)BSA,RNA-seq和连锁分析锁定目标基因。

 

 

小结

本文是DNA和RNA两组学整合,筛选候选基因的案例,思路清晰,两组学结合缩小了候选基因的筛选范围,高效的锁定了目标基因;良好的样本是成功的一半,作者通过多年的积累得到甘蓝型油菜的近等基因系,为后续工作打好基础。

 

 

参考文献

Teng, Changcai, et al. "Mapping and Identifying a candidate gene (Bnmfs) for female-male sterility through whole-genome resequencing and RNA-Seq in rapeseed (Brassica napus L.)." Frontiers in plant science 8 (2017): 2086.