已知RNA存在超过100种修饰,m6A甲基化是真核生物mRNA最普遍存在的修饰。m6A主要富集在mRNA的启动子区、终止密码子区附近。RNA甲基化免疫共沉淀 (Methylated RNA Immunoprecipitation,MeRIP)基于m6A特异性抗体识别并结合mRNA上的m6A的原理,以RNA免疫共沉淀方法富集甲基化修饰片段为基础,并联合高通量测序,在全转录组范围内研究发生m6A甲基化修饰的RNA区域。

 

应用领域

1. 真核生物RNA甲基化分布
2. 动植物mRNA甲基化与环境胁迫应答机制
3. mRNA抗降解机制
4. 肿瘤相关发生、增殖机制

 

 

技术路线

 
 
分析内容
 
标准信息分析
(需提供参考基因序列、参考基因组序列及基因注释结果)
1  测序评估: 测序质量评估、碱基组成与质量分析、过滤信息统计
2  比对分析:比对基因组统计、Reads在染色体上的分布、插入片段大小分布
3  Peak分析:Peak calling、Peak长度分布、Peak深度分布、Peak富集倍数分布
4  Peak注释:Peak 相关基因分析、Peak在基因功能元件上的分布、Peak相关基因的GO/Pathway功能富集分析
5  motif 分析
6  多样品间的差异peak分析:样品相关性分析、差异peak统计、差异peak在基因功能元件上的分布、差异peak相关基因分析、差异peak相关基因GO/KEGG功能富集分析

 

样品要求

样本类型:来源于培养细胞、全血及动植物组织的细胞样本或RNA样品;
1) 如客户自行开展meRIP实验,单次建库需要IP后RNA 总量>2 ng,IP后的RNA浓度>100 pg/ul,片段<300nt,不含有EDTA,无DNA污染(建议至少送满足两次建库的量);
2) 如需公司进行m6A IP 实验,单次IP实验所需的样本量为:RNA 送样量>12 μg(细胞数量最低建议在107以上,动物组织样品至少1.5 g,植物组织样品至少2g),RNA浓度要>350 ng/ul,不含有EDTA,无DNA污染。如果条件许可,可以多送2~3倍的样本量,进行备份。

 

 

参考文献

[1] Li X, Xiong X, Yi C, et al. Epitranscriptome sequencing technologies: decoding RNA modifications[J]. Nature Methods, 2017, 14(1): 23-31
[2] Zhang, C., Chen, Y., Sun, B. et al. m6A modulates haematopoietic stem and progenitor cell specification. Nature 549, 273–276 (2017). 
[3] He, P.C., He, C. mRNA acetylation: a new addition to the epitranscriptome. Cell Res 29, 91–92 (2019).
[4] Luo GZ, MacQueen A, Zheng G, et al. Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana. Nat Commun. 2014;5:5630. Published 2014 Nov 28. doi:10.1038/ncomms6630

 

 

 

 

 

Q1m6A测序对于生物学重复有什么样的要求?

A:建议生物学重复大于3个。

 

 

Q2单个样品的细胞数量比较少,达不到检测要求,该怎么处理?

A:可以考虑把相同处理的多个样品混合成一个生物学重复进行测序,同样建议生物学重复数大于3个。

 

 

Q3感兴趣的基因上没有检测到m6A的peak信号,有哪些方案调整?

A:可以考虑适当调低差异倍数、调高p值两个指标重新分析。

 

 

 

 

m6A去甲基化酶ALBBH10B调控拟南芥成花转变

m6A是所有高等真核生物中最丰富的mRNA转录后修饰,在哺乳动物中,这种修饰是可逆的,并且在mRNA加工调节中起广泛作用,但是关于m6A甲基化在拟南芥,甚至是在植物中的作用和机制的研究仍然偏少。拟南芥中已鉴定了大量RNA甲基化酶,其中ALKBH10B是一种去甲基酶,氧化逆转mRNA中的m6A甲基化。

研究证实ALKBH10B行使去甲基化功能,突变alkbh10b延迟了开花并抑制了营养生长,且ALKBH10B介导的mRNA去甲基化是通过影响靶转录物的稳定性,进而影响花的转变。m6A-seq结果显示,alkbh10b突变引起拟南芥整体m6A修饰水平降低;相较于野生型拟南芥,突变体中共鉴定了1190个过甲基化修饰转录本,直接或间接受到了ALKBH10b的调控;m6A修饰主要位于TSS、TES、3’UTR及5’UTR附近;功能富集分析结果表明,过甲基化修饰转录本主要与器官组织发生、种子休眠后胚胎发育及生殖成熟等生物学过程相关。

 

图1 m6A peak富集区域分布

 

 

m6A去甲基化酶在急性髓性白血病中有致癌作用

图2 FTO询控靶基因m6A修饰水平

m6A在哺乳动物中具有功能重要性 ,但在癌症中的功能还知之甚少。FTO作为首个确定的m6A去甲基化酶 ,自发现以来一 直是研究的热点。急性髓性白血病 (AM L )是最常见也是致命的造血系统恶性肿瘤之一 ,由千遗传和分子多样性,临床治疗存在明显地个体化差异。研究试图揭示FTO在AML中的发病机制和药物反应中的生物学功能,并通过鉴定FTO的关键rnRNA靶标来研究其潜在的分子机制。

研究表明,FTO在AML临床样本表达下调,能够促进细胞增殖,抑制体外凋亡;在小鼠模型中,过表达FTO会加速白血病病情恶化 ,降低小鼠存活时间。对过表达FTO细胞系和正常AM L细胞系进行m6A-seq和RNA-seq分析发现 ,FTO显著下调1116A修饰水平 ;结合差异倍数和基因功能 ,确定了两个靶基因ASB2和RARA , FTO通过去甲基化修饰调节靶基因表达水平。

 

 

参考文献

[1]Li Z, Weng H, Su R, et al. FTO plays an oncogenic role in acute myeloid leukemia as a N 6-methyladenosine RNA demethylase[J]. Cancer cell, 2017, 31(1): 127-141